¿Qué es CRISPR/Cas9?

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Ciudad de México, 21 de Enero 2021 (OpenLabMX: Jesús Sixtos).-

Lo primero que se debe mencionar, es que se trata de una de las herramientas más potentes, precisas y versátiles de la biología molecular, siendo ampliamente utilizada para edición genética hoy en día. Este sistema ha modificado de manera radical nuestros alcances en la ingeniería genómica, ya que -entre otras cosas- nos permite remover, agregar, alterar o detectar secuencias de DNA y/o RNA dentro de cualquier organismo vivo con una gran eficiencia y efectividad (1).

Imagen tomada de: https://img.freepik.com

Sus inicios se remontan a 1987 en Osaka, donde Ishino y colaboradores evidencian la existencia de un conjunto de secuencias repetidas de 29 nucleótidos espaciadas por otros 32 nucleótidos, todo esto dentro de un fragmento de DNA que codifica para el gen iap expresado por una cepa de Escherichia coli (2). Sin embargo, fué hasta la primera década del siglo XXI que se identificaron y establecieron de manera precisa las moléculas y mecanismos involucrados en la formación del complejo CRISPR/Cas, así como el procesamiento del RNA con la secuencia complementaria (crRNA) (3). Esta herramienta molecular proviene del sistema inmune adaptativo presente en algunas bacterias y archeas (4-5), nombrado como CRISPR/Cas por su acrónimo  en inglés –Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated– por Mojica y Jansen (6-7).

Es importante mencionar que existen otros sistemas de edición genética además de CRISPR, como las nucleasas dedos de zinc (ZFN) y las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN). Actualmente se sabe que las ZFN y los TALEN son ineficientes, pues las primeras suelen generar escisión fuera del sitio blanco, en tales escenarios, el mecanismo de reparación del DNA dentro de la célula editada no puede controlar la sobreproducción de roturas bicatenarias y, en consecuencia, se produce un reordenamiento cromosómico inesperado o incluso la muerte celular. Respecto a los TALEN, al igual que los ZFN, también muestran el efecto objetivo, lo cual eventualmente generará un reordenamiento cromosómico no deseado debido a la presencia de rupturas no contempladas en la doble cadena de DNA (8-9). Otro método utilizado para la edición genética es por recombinación homóloga, en el cual se utilizan diversas enzimas de restricción para efectuar la eliminación de ciertos genes a partir de PCR, por lo cual se usa ampliamente en la ingeniería genética. No obstante lo anterior, la eficiencia de la recombinación homóloga, como un sistema de ingeniería genética, es considerablemente baja (10-11).  Por otro lado, el sistema CRISPR surge como una tecnología más efectiva en comparación con los TALEN y los ZNF, pues es más fácil de usar, dado que únicamente el crRNA requiere de un cierto rediseño para atacar específicamente a cualquier región del genoma (12-13).

Principales sistemas de edición genética. Los sistemas ZFN (a) y TALEN (b) constan de dos componentes: 1) la tijera molecular y 2) el indicador de posición programable. En el sistema CRISPR/Cas9 (c), el RNA guía es quien permite reconocer de forma específica la secuencia de DNA de interés, a partir de complementariedad de bases. Imagen tomada de Eid A. & Mahfouz M., 2016. https://media.springernature.com

Se han desarrollado variantes de este sistema que utilizan además de la proteína con dominios de helicasa-endonucleasa, Cas9, proteínas como Cas12 y ortólogos de Cas13 (14). Algunas de estas variantes se han fusionado con una gran cantidad de proteínas efectoras para regular fenómenos de expresión génica, modificaciones epigenéticas e interacciones de la cromatina.

¿Cómo funciona CRISPR?

Para que el sistema de edición genómica perpetre los cortes en el DNA, se requieren únicamente dos componentes: la proteína Cas9 y el RNA guía. Primero que nada, la Cas9 presenta en su estructura dos lóbulos funcionales, en uno de estos se lleva a cabo el reconocimiento de la secuencia diana (lóbulo REC) y en el otro se presenta la actividad de nucleasa (lóbulo NUC) (15). Este último lóbulo está conformado por dos dominios de nucleasa, HNH y RuvC. Para efectuar el corte de doble cadena, el dominio HNH actúa sobre la hebra complementaria al RNA guía, mientras que RuvC ataca a la cadena no complementaria al RNA guía, esto sobre la secuencia objetivo. Ahora bien, como ya se mencionó, la otra mitad del sistema CRISPR/Cas9 de diseño consiste en un componente de RNA duplex, constituido por un RNA transcrito de CRISPR (crRNA) y la molécula de crRNA transactivador (tracrRNA), denominado de forma general RNA guía. El crRNA se complementa con su secuencia blanco o protoespaciador, a partir de complementariedad de bases a lo largo de 20 nucleótidos. En el extremo 3’ de estos 20 nucleótidos, se halla una repetición que se aparea con el tracrRNA, formando una estructura de varias horquillas. De esta forma, el tracrRNA es fundamental para la unión del RNA guía con la Cas9 y la buena orientación de éste para dar una interacción correcta entre el crRNA y su secuencia diana . Por lo tanto, podemos decir que la función general del RNA guía es darle la especificidad de reconocimiento a la Cas9 (15-18).

Estructura cristalina de Cas9 en complejo con ARN guía y ADN objetivo. A.- Se muestra la representación gráfica de la estructura del complejo Cas9-sgRNA-DNA. Imagen tomada de Nishimasu et al. 2014.

Perspectivas y contribuciones de CRISPR/Cas9

CRISPR, al ser un sistema de edición genética, está siendo utilizado en la actualidad para modificar genéticamente a una buena variedad de organismos, tomando distintos enfoques y objetivos. Por ejemplo, es una herramienta muy prometedora para la investigación de desórdenes genéticos, así como la creación de nuevas terapias. Particularmente, se han generado estudios prometedores empleando CRISPR/Cas9 en el estudio de diferentes tipos de cáncer, con el fin de generar nuevos blancos terapéuticos (19-24). Igualmente, desde un enfoque clínico, se puede utilizar la variante CRISPRi (CRISPR-interference) para inactivar transitoriamente genes en microorganismos patógenos como bacterias, hongos, etc (25-27). para reconocer potenciales blancos para nuevos agentes antimicrobianos. De hecho, se ha demostrado que también se puede usar este sistema para detectar secuencias específicas en el genoma para detectar la presencia de distintos virus, por ejemplo, el causante de la actual pandemia, el SARS-Cov-2 (28-29).

Finalmente, también se le ha dado un atractivo enfoque económico, pues está siendo utilizado para generar animales y plantas genéticamente modificadas, con el fin de mejorar, optimizar y volver sostenibles los sistemas de producción actuales, lo cual no sólo beneficia a la economía global, desde los productores hasta los consumidores, sino que es un paso agigantado en la búsqueda y creación de sistemas económicos de bajo impacto ambiental (30-32).


Referencias:

[1]. – Zhang F. (2019). Development of CRISPR-Cas systems for genome editing and beyond. Quarterly Reviews of Biophysics. 52 (E6): pp. 1-31
[2]. – Ishino Y. et al. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology.; 169 (12): pp. 5429-5433
[3]. – Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C., Gonzalez K., Chao Y., Pirzada Z. et al. (2011). CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature.; 471 (7340): pp.602-607
[4]. – Mojica F. et al., (2009). Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology.; 155 (3): pp.733-740
[5]. – Barrangou R., et al. (2007) CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science.; 315 (5819): pp. 1709-1712.
[6]. – Mojica F. et al., (2000). Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Molecular Microbiology.; 36 (1): pp.244-246
[7]. – Jansen R. et al., (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology.; 43 (6): pp.1565-1575
[8]. – Gaj T., Gersbach A. & Barbas C. (2013). ZFN, TALEN and CRISPR/Cas: based methods for genome engineering. Trends Biotechnol.; 31 (7): 397-405
[9]. – Eid A. & Mahfouz M. (2016). Genome editing: the road of CRISPR/Cas9 from bench to clinic. Experimental & Molecular Medicine.; 48, e265.
[10]. – Kanieck K., De Tullio L. & Greene E. (2018). A change of view: homologous recombination at single molecule resolution. Nat Rev Genet.; 19 (4): 191-207
[11]. – Sharan S., Thomason L., Kuznetsov S & Cour D. (2009). Recombineering: A Homologous Recombination-Based Method of Genetic Engineering. Nat Protoc.; 4 (2): pp. 206-223
[12]. – O’Geen H.†, Ren C.†, Nicolet C., Perez A., Halmai J., Le V., Mackay J., Farnham P. & Segal D. (2017). dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Research.; 45 (17): pp. 9901-9916
[13]. – Zhao J., Lai L., Weizhi J. & Zhou Q. (2019). Genome editing in large animals: current status and future prospects. Natl Sci Rev.; 6 (3): pp. 402-420
[14]. – Makarova K., Aravind L., et al., (2011). Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems. Biology direct.; 6(1): pp.38
[15]. – Nishimasu H., Ran A., Hsu D., et al. (2014). Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell.; 156: pp. 935-949
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[18]. – Jinek M. et al. (2014). Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science (New York, N.Y.).; 343 (6176): pp.1215-1226
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[32]. – Wang X., Zhou J., Cao C., et al. (2015). Efficient CRISPR/Cas9-mediated biallelic gene disruption and site-specific knockin after rapid selection of highly active sgRNAs in pigs. Scientific Reports.; 5:13348

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